Analisis kuantitatif proses biokimia dalam sel hidup pada tingkat molekul tunggal: kasus interaksi olaparib-PARP1 (protein perbaikan DNA)

Deskripsi kuantitatif proses biokimia di dalam sel hidup dan pada tingkat molekul tunggal tetap menjadi tantangan di garis depan instrumentasi dan spektroskopi modern. Makalah ini menunjukkan analisis sel tunggal, molekul tunggal yang dilakukan untuk mempelajari mekanisme kerja olaparib – obat terbaru yang disetujui FDA untuk kanker payudara metastatik bermutasi germline-BRCA. Kami mengkarakterisasi kompleks yang dibentuk dengan PARPi-FL – analog fluoresen olaparib in vitro dan pada sel kanker menggunakan metode berbasis fluoresen canggih: Spektroskopi Korelasi Fluoresensi (FCS) dikombinasikan dengan model viskositas sitoplasma/nukleoplasma yang bergantung pada skala panjang. Kami memutuskan in vitro konstanta kesetimbangan olaparib–PARP1 (6,06 × 10⁸ mol L¹). Dalam inti sel, kami membedakan tiga keadaan olaparib: obat yang menyebar bebas (24%), kompleks olaparib-PARP1 (50%), dan kompleks olaparib-PARP1-RNA (26%). Kami menunjukkan akumulasi olaparib dalam spheroid 3D, di mana konsentrasi intraseluler dua kali lipat lebih tinggi daripada di sel 2D. Selain itu, konsentrasi olaparib sepuluh kali lipat lebih tinggi (506 nmol L¹ vs. 57 nmol L¹) pada kanker serviks (BRCA1 kelimpahan tinggi) dibandingkan pada sel kanker payudara (BRCA1 kelimpahan rendah) tetapi dengan efek toksik yang lebih rendah. Jadi kami mengkonfirmasi bahwa jumlah protein BRCA1 dalam sel adalah prediktor yang lebih baik dari efek terapeutik olaparib daripada penetrasinya ke dalam jaringan kanker. Pendekatan molekul tunggal dan sel tunggal kami memberikan perspektif baru tentang aksi obat dalam sel hidup. FCS memberikan detail in vivo wawasan, berharga dalam pengembangan dan penargetan obat.