Estimasi resolusi tinggi dari kelimpahan gen relatif dengan PCR regresi rasiometrik kuantitatif (qRR-PCR)

Kuantifikasi kelimpahan relatif sifat genetik memiliki aplikasi luas untuk penemuan biomarker, diagnostik, dan penilaian ekspresi gen dalam penelitian biologi. Kuantifikasi relatif gen secara tradisional dilakukan dengan 2^CT metode yang menggunakan data kuantitatif real-time polymerase chain reaction (qPCR), yang seringkali terbatas dalam resolusi di luar urutan perbedaan besarnya. Teknik terbaru untuk kuantifikasi asam nukleat menggunakan PCR digital atau microarrays yang melibatkan persiapan sampel yang panjang dan instrumentasi yang kompleks. Dalam karya ini, kami menjelaskan metode PCR regresi rasiometrik kuantitatif (qRR-PCR) untuk menghitung kelimpahan relatif sifat genetik dalam sampel dengan resolusi tinggi dari uji PCR kuantitatif real-time dupleks tunggal. Alih-alih membandingkan nilai ambang siklus individu (Ct) seperti yang dilakukan untuk 2^CT metode, algoritma qRR-PCR kami memanfaatkan hubungan bawaan dari target PCR yang diperkuat bersama untuk mengukur jumlah relatifnya menggunakan kurva karakteristik yang berasal dari rasio normal kurva fluoresensi qPCR. Kami mendemonstrasikan kegunaan teknik ini untuk membedakan kelimpahan fraksi alel campuran dengan resolusi di bawah 5%.