Perbandingan crosslinker yang dapat diaktifkan dengan foto untuk immunoassays in-gel

Sementara pembacaan fluoresensi adalah modalitas deteksi utama untuk imunoassay berbasis hidrogel, fluoresensi latar belakang karena autofluoresensi atau interaksi antibodi non-spesifik merusak batas bawah deteksi imunoassay fluoresensi. Modifikasi kimia pada struktur hidrogel berdampak pada autofluoresensi dan interaksi non-spesifik. Benzofenon adalah molekul fotoaktif umum, dan benzofenon metakrilamida (BPMA) telah digunakan untuk protein pengikat silang dalam hidrogel poliakrilamida (PA). Namun, penelitian sebelumnya telah menyarankan bahwa struktur aromatik benzofenon dapat berkontribusi pada peningkatan autofluoresensi dan interaksi hidrofobik non-spesifik dengan probe fluoresen yang tidak terikat. Di sini, kami mensintesis diazirine methacrylamide (DZMA) sebagai molekul alternatif yang dapat diaktifkan fotonya untuk berikatan silang ke hidrogel PA untuk penangkapan protein in-gel untuk immunoassay in-gel. Kami berhipotesis bahwa struktur diazirin yang kurang hidrofobik (berdasarkan log prediksi dan eksperimental yang dilaporkan sebelumnya)P nilai) menunjukkan penurunan autofluoresensi dan interaksi hidrofobik non-spesifik. Kami menemukan bahwa sementara konsentrasi DZMA dan BPMA yang sama menghasilkan fotocapture target protein yang lebih rendah dalam konfigurasi diazirine, meningkatkan konsentrasi DZMA hingga 12 mM meningkatkan penangkapan protein dalam gel menjadi setara dengan hidrogel BPMA 3 mM yang dilaporkan dan dikarakterisasi sebelumnya. Selain itu, meskipun konsentrasi diazirine lebih tinggi, kami mengamati sinyal autofluoresensi yang dapat diabaikan dan pengurangan 50% dalam sinyal latar belakang fluoresensi immunoassay dalam gel diazirin dibandingkan dengan gel BPMA yang menghasilkan rasio signal-to-noise (SNR) yang sebanding dari target protein yang diperiksa. Akhirnya, kami menguji kegunaan DZMA untuk imunoblotting sel tunggal dalam perangkat mikofluida terbuka dan menemukan bahwa protein bermigrasi 1,3× lebih cepat dalam hidrogel DZMA daripada di hidrogel BPMA. Namun, dalam hidrogel DZMA kami mendeteksi hanya 15% dari sinyal protein dibandingkan dengan hidrogel BPMA yang menunjukkan bahwa kimia diazirin menghasilkan kehilangan protein yang lebih besar setelah pemisahan elektroforesis. Kami menetapkan bahwa sementara diazirin memiliki sinyal fluoresensi latar belakang yang lebih rendah, yang berpotensi meningkatkan kinerja immunoassay, efisiensi penangkapan yang lebih rendah dari diazirin mengurangi kegunaannya dalam sistem mikofluida terbuka yang rentan terhadap kehilangan sampel.