Strategi pelabelan dengan pengawetan fluorofor yang efektif untuk ekspansi mikroskop lokalisasi molekul tunggal (Ex-SMLM)

Mikroskop Ekspansi (ExM) secara signifikan meningkatkan resolusi mikroskop optik terbatas difraksi konvensional dengan menggunakan sampel biologis yang diperluas secara fisik. Menggabungkan ExM dengan mikroskop lokalisasi molekul tunggal (SMLM) dapat lebih meningkatkan daya pisah SMLM, yang biasanya pada urutan 20-30 nm. Namun, untuk membuat kombinasi ini berhasil, kita perlu memecahkan tiga masalah utama yang terkait dengan preparasi sampel, termasuk terutama penyusutan hidrogel dalam buffer photowitching ionik, photobleaching fluoresensi karena reaksi radikal bebas dan pengurangan efisiensi pelabelan dari pencernaan protease. Menggunakan re-embedding gel poliakrilamida atau buffer photoswitching yang ditingkatkan dengan kekuatan ion rendah dapat meminimalkan atau bahkan memecahkan masalah penyusutan hidrogel, sementara pengembangan pendekatan pelabelan pasca-ekspansi menghindari pemutihan fluoresensi. Namun, pelestarian epitop protein (yang menentukan efisiensi pelabelan) tetap menjadi tantangan. Dalam makalah ini, kami mengusulkan untuk mengatasi tantangan ini dengan memasukkan interaksi biotin-streptavidin yang sangat selektif dan stabil ke dalam strategi pelabelan pasca-ekspansi. Setelah memutakhirkan skema hubungan imunolabel populer dari Epitope-Primary antibody-Secondary antibody-Fluorophores menjadi Epitope-Primary antibody-Secondary antibody-Biotin-Streptavidin-Fluorophores, kami dapat memberi label pada epitop protein dengan Biotin, yang stabil selama proses ekspansi, dan dengan demikian menghindari masalah merepotkan dalam melestarikan epitop protein atau antibodi. Kami menunjukkan bahwa menggabungkan Ex-SMLM dengan skema tautan pasca-ekspansi baru memungkinkan kemungkinan baru dalam menyelesaikan pengaturan terperinci protein Nup133 dalam kompleks pori nuklir, yang membantu para peneliti mengamati struktur yang lebih jelas. Studi ini memberikan peluang baru untuk mempelajari detail ultrastruktur organel subseluler atau bahkan biomakromolekul, menggunakan sistem SMLM konvensional.