Strategi pelabelan dengan pengawetan fluorofor yang efektif untuk mikroskop lokalisasi molekul tunggal ekspansi (Ex-SMLM)

Mikroskop ekspansi (ExM) secara signifikan meningkatkan resolusi mikroskop optik terbatas difraksi konvensional dengan menggunakan sampel biologis yang diperluas secara fisik. Menggabungkan ExM dengan mikroskop lokalisasi molekul tunggal (SMLM) dapat lebih meningkatkan daya pisah SMLM, yang biasanya berkisar 20-30 nm. Namun, untuk membuat kombinasi ini berhasil, kita perlu memecahkan tiga masalah utama yang terkait dengan preparasi sampel, termasuk terutama penyusutan hidrogel dalam buffer pengalih foto ionik, pemutihan foto fluoresensi karena reaksi radikal bebas dan pengurangan efisiensi pelabelan dari pencernaan protease. Menanamkan kembali gel poliakrilamida atau menggunakan buffer photoswitching yang ditingkatkan dengan kekuatan ionik rendah mampu meminimalkan atau bahkan memecahkan masalah penyusutan hidrogel, sementara pengembangan pendekatan pelabelan pasca-ekspansi menghindari pemutihan fluoresensi. Namun, pelestarian epitop protein (yang menentukan efisiensi pelabelan) tetap menjadi tantangan. Dalam makalah ini, kami mengusulkan untuk mengatasi tantangan ini dengan memperkenalkan interaksi biotin-streptavidin yang sangat selektif dan stabil ke dalam strategi pelabelan pasca-ekspansi. Setelah meningkatkan skema hubungan imunolabel populer dari Epitop–Antibodi primer–Antibodi sekunder–Fluorofor ke Epitop–Antibodi primer–Antibodi sekunder–Biotin–Streptavidin–Fluorofor, kami dapat memberi label epitop protein dengan biotin, yang stabil selama proses ekspansi, dan dengan demikian menghindari masalah yang merepotkan dalam melestarikan epitop protein atau antibodi. Kami menunjukkan bahwa menggabungkan Ex-SMLM dengan skema tautan pasca-ekspansi baru memungkinkan kemungkinan baru dalam menyelesaikan pengaturan terperinci protein Nup133 dalam kompleks pori nuklir, yang membantu para peneliti untuk mengamati struktur yang lebih jelas. Studi ini memberikan peluang baru untuk mempelajari detail ultrastruktur organel subseluler atau bahkan biomakromolekul, menggunakan sistem SMLM konvensional.